Las bases de la espectrofotometría

El color esta por doquier en nuestras vidas. ¿Sabías que es posible medir el color? El espectrofotómetro es una herramienta esencial para los biólogos y técnicos para analizar muestras químicas y biológicas.
Este blog resumirá algunas de las bases de la espectrofotometría y diferentes configuraciones.

Luz y color

En términos simples, los colores dependen de la luz. Nosotros no vemos los colores, en su lugar, lo que vemos cómo color es el efecto de la luz que “brilla” en un objeto. Cuando la luz blanca “brilla” sobre un objeto, puede que sea reflejada, absorbida o transmitida. El vidrio transmite la mayoría de la luz que entra en contacto con él, por lo que parece transparente. La nieve refleja toda la luz, por lo que se ve blanca. La tela negra absorbe toda la luz, y por esta razón aparece negra. Una pieza roja de papel refleja la luz roja mejor que otros colores. La mayoría de objetos están coloreados pues su estructura química absorbe ciertas longitudes de onda y refleja otras.

Al discutir sobre la luz, normalmente nos referimos a la luz blanca. Una pequeña línea de luz se llama rayo; un haz se fábrica a partir de muchos rayos de luz. Cuando la luz blanca atraviesa un prisma (un objeto triangular transparente) los colores que componen la luz blanca se dispersan en siete bandas de color. Estas bandas de color se llaman espectro. Los siete colores que constituyen la luz blanca son: rojo, naranja, verde, azul, índigo y violeta. En cualquier espectro, estas bandas de color siempre están organizadas de izquierda a derecha.

Suponga que un haz de luz blanca que absorba la luz azul. Ya que el componente de luz azul de la luz blanca se absorbe por la sustancia, la luz que se transmite será en su mayoría amarilla, el color complementario al azul. La luz amarilla alcanza nuestros ojos, y “vemos” la sustancia coloreada de amarillo.

La variación de color en el sistema experimenta un cambio en la concentración de algún componente es la base del análisis colorimétrico.

¿Qué es colorimetría?

La colorimetría simplemente es la medición de color. Y permite determinar la concentración de una sustancia y mide la absorción relativa de luz con respecto a una concentración conocida de una sustancia. En la colorimetría visual; la luz blanca natural o artificial se usa generalmente como una fuente de luz y las lecturas se realizan con un instrumento simple denominado colorímetro o comparador de color. Cuando el ojo se remplaza por una celda fotoeléctrica, el instrumento se denomina un colorímetro fotoeléctrico.

El análisis colorimétrico se basa en el principio de que muchas sustancias reaccionan con otras y forman color, lo que puede indicar la concentración de la sustancia medida. Cuando una sustancia se expone a un haz de luz de alta intensidad (I0) una porción de la luz se absorbe por las moléculas de la sustancia y una radiación de intensidad (I) se emite. Esta diferencia en intensidad se usa para la determinación colorimétrica.

La cantidad de radiación absorbida se da por la ley de Lamber-Beer:

• A = Ɛ · l · C

Donde:

• A es la absorbancia
• Ɛ es el coeficiente de extinción molar [L/(mol·cm)]
• l es el camino del haz de luz (cm)
• C es la concentración (mol/L)

Fotómetro vs Espectrofotómetro

Fotómetro

Un fotómetro aísla una longitud de onda específica de la luz, usando filtros. Un colorímetro usa filtros de banda estrecha, o algún sistema simular, para separar la luz en sus componentes, y entonces se ajusta a las curvas basadas en el ojo humano, para producir los valores de color que usted vería. Esto es ideal para emparejarse con la respuesta visual, pero no dice nada de la información invisible al ojo humano, como son las puntas de emisión del espectro; esa información espectral requiere de un espectrofotómetro.

Espectrofotómetro

Los espectrofotómetros son diferentes de los fotómetros pues permiten la medición del espectro en todas las longitudes de onda para la luz visible y no solo longitudes de onda pre-especificadas. Los espectrofotómetros trabajan aislando la luz de longitudes de onda específica a partir de la luz blanca. Un espectrofotómetro rompe la luz en su espectro, usando una rejilla de color o un sistema similar. Luego un conjunto de sensores lee cada sección del espectro, produciendo la información espectral. Esto es ideal si usted está analizando la emisión espectral de un bulbo de luz, un foco, u otra fuente de luz, por lo que los espectrofotómetros se usan como instrumentos científicos.

Configuración óptica del espectrofotómetro:

• Haz simple
  En un espectrofotómetro convencional de un solo haz, el blanco y la muestra se miden de manera consecutiva, con un intervalo de va desde varios segundos para lecturas con una sola longitud de onda hasta varios minutos para lecturas de todo el espectro. Las desviaciones de la lámpara pueden resultar en errores significativos durante largos intervalos de tiempo.
• Doble haz
  El espectrofotómetro doble, o de doble haz, se desarrolló para compensar estos cambios en la intensidad de la lámpara entre las mediciones del blanco y las muestras. En esta configuración, la fuente de luz emite un solo haz de luz que se divide por un cortador, lo que crea dos haz de igual energía e idéntico camino óptico. Un haz pasa a través de la referencia mientras que el otro atraviesa la muestra. Comparado con el diseño de un solo haz, los instrumentos dobles contienen más componentes ópticos, lo que se reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para mayor sensibilidad, pueden requerirse mayores periodos de medición. De manera adicional, para un diseño mecánico más complejo de los espectrofotómetros de doble haz puede causar menor repetibilidad.
• Haz dividido
  Los espectrofotómetros de haz dividido son una reestructuración de los espectrofotómetros de doble haz; pero en lugar de un cortador usan un divisor de haz para enviar la luz a través del blanco y la muestra de manera simultánea, por dos detectores separados pero idénticos. Esta configuración permite medir de manera simultánea tanto el blanco y la muestra. El diseño de haz dividido es mecánicamente más simple que el diseño de doble haz, y requiere de menos componentes ópticos.
• Los mejores usos para un espectrofotómetro
  Los espectrofotómetros actuales están diseñados para ser tanto duraderos y portátiles, ofreciendo flexibilidad en su uso. Mientras que las aplicaciones son casi ilimitadas, algunos de los mayores usos incluyen:
  Determinación elemental de calidad de agua.
• Análisis enzimático de vinos
• Análisis de propiedades fertilizantes para la agricultura.
• Estos son algunos de los muchos usos potenciales de un espectrofotómetro.